Preparation and Identification of Antiserum
一．原理
免疫血清或称抗血清，为含有某种抗原特异性的抗体分子的动物血清，一般是从通过人工注射某种抗原的免疫动物制备的。优质的高效价抗血清可用于教学、科研以及疾病的诊断和治疗。
某种物质进入体内后能否引起被免疫的动物产生抗体生成反应，一方面取决于抗原分子表面有无特异性的抗原决定簇（Antigenic Determinant）或称表位（Epitope）；另一方面取决于被免疫动物的机体的免疫状态。当具备上述两个条件时，如果抗原剂量合适，免疫接种的途径恰当，被免疫的动物就将遵循抗体生成的一般规律——初次反应和再次反应，产生抗体并获得免疫血清。制备免疫血清除需要纯化抗原外、还需要选择合适的动物及恰当的注射途径，优质的高效价免疫血清还与注射的抗原剂量，接种的次数等有着密切的关系。
二．抗原
为了制备特异性强，效价高，亲和力好的优质免疫血清。首先必须要有合适的抗原。免疫血清的特异性除了与抗原的分子量大小有关外，还与抗原分子表面抗原决定簇的性质、空间位置、立体构象以及种属差异等密切相关。抗原的种类繁多，依其来源的不同可以分为天然抗原、人工抗原、合成抗原，重组抗原等。天然抗原又可分为可溶性抗原（如血清、毒素，组织浸出液，组织或细胞蛋白质等）、颗粒性抗原（如细菌、病毒、细胞等）、半抗原（本身无免疫原性，必须与载体蛋白结合后才有免疫原性，如青霉素、氯霉素、雌激素、胰岛素等）、合成性抗原（如多肽等）以及基因工程抗原等。
三．动物的选择
家兔、羊、马、驴、大鼠、小鼠、豚鼠、鸡、猴等都是常用的免疫动物，在实验中，选择动物时应考虑抗原与动物的种属关系、抗原性质与动物种类、免疫血清需要量、免疫血清要求以及动物个体和用途等因素。实验用免疫血清多选用家兔、大鼠、小鼠、豚鼠和鸡，商业用生产多用马、羊、驴，特殊情况选用猴。此外，免疫用动物还应选适龄、健壮．最好为雄性。
实验用免疫血清最常用的动物是家兔，一般选择选择当年繁殖的，体重2～3公斤，年龄在6个月以上的雄性，健康家兔，免疫前用金属编号牌固定兔耳，或用染料涂沫在动物的背部，做出明确的标记。免疫前，还应采血测定动物体内有无低滴度交叉反应性天然抗体的存在。
四．免疫途径，免疫剂量和免疫周期
不同的免疫途径，抗原在体内的的代谢速度不同，对免疫系统的刺激强弱也就不同，因而，产生抗体的水平也就不同。抗原的注射途径可根据免疫动物个体的大小、抗原及抗体制备目的或要求的不同，选用皮内、皮下、肌肉、静脉、淋巴结内或腹腔等不同途径注入抗原进行免疫。一般家兔常采用背部、足掌、淋巴结周围、耳后等处皮内或皮下多点注射，皮内和肌肉途径较少采用。
免疫原的注射剂量随抗原的性质有较大差异。一般应考虑抗原的免疫原性的强弱、分子量大小、抗原的纯度、毒性的有无以及动物个体的状态、免疫途径和免疫时间，佐剂的使用与否等。对于纯的可溶性抗原，免疫时一般需要与等量的弗氏完全佐剂（Freund’s Complete Adjuvant）混合，其免疫剂量通常小鼠首次抗原剂量为50～100μg/次，大鼠为100～200μg/次，兔为100μg～1000μg/次，合成免疫原为2 mg(半抗原约为20～200μg)。加强免疫的剂量为首次计量的1/2，可用不完全弗氏佐剂或不用佐剂。如需制备高度特异性的抗血清，可选用低剂量抗原短程免疫法；反之，欲获得高效价的抗血清，宜采用大剂量抗原长程免疫法。
免疫周期一般随抗原和免疫方法的不同以及是否使用佐剂而变化。间隔时间可从数日到数周，一般无佐剂时间隔2-4天，加用佐剂时可间隔10-30天。初次免疫与第二次免疫的间隔时间多为2～4周，此后，每次加强免疫的间隔时间为2-3周。
五．佐剂
佐剂又称免疫增强剂。它可以增强抗原的免疫原性以及改变机体的免疫反应性，达到增强免疫力或提高抗体产生水平以及使抗原在体内维持时间明显延长等功效。佐剂的种类很多，在免疫血清的制备中通常多用弗氏佐剂（Freund’s Adjuvant）,也有学者译为福氏佐剂。弗氏佐剂分为弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂(Freund’s Incomplete Adjuvant)。二者主要的差别在于弗氏完全佐剂含有卡介苗。
六．免疫原的制备
1.抗原稀释：免疫用的抗原一般应使用新配制的灭菌生理盐水或PBS稀释，然后再与佐剂等量混合制成乳剂后用于动物免疫。
2.抗原的乳化：乳化的方法有乳钵研磨法、注射器推注法，超声乳化法和机械搅拌法等多种。
1）注射器推注法：是将抗原溶液和等量的完全佐剂（注意佐剂必须预先加热融化，但不超过50℃）分别吸入两个5ml注射器内，在两个注射器的12#针头间用一根长约数厘米的医用无毒塑料管，将两个注射器连接在一起（塑料管必须先经酒精浸泡消毒，使用时取出，用灭菌生理盐水冲洗后，与注射器针头相连接，塑料管与针头的口径须合适，不能松，稍紧些为宜），针头插进塑料管约1～2cm然后由两人相对而坐，缓缓推动针栓，使管内溶液进入塑料管道至对侧注射器内，每次推动针栓时必须把注射器的内容物全部推出，另一侧也同样操作，使管内液体往返混合，直至形成油包水乳剂（Water-in-oil emulsion）为止。
2）乳钵研磨法：是将抗原溶液和等量的佐剂加入到乳钵内，经过反复碾磨，也可形成油包水乳剂，该法主要优点是快速，可靠，不足方面主要是由于粘附过多，浪费佐剂及抗原。
抗原的乳化程度直接影响免疫效果，因此，必须进行质量检查，检查的方法是将制成的乳剂滴一滴在凉的自来水表面，质量合格的乳剂滴入水面后应保持乳滴珠完整而不分散；如进入水面后立即扩散，水面油花亦逐渐扩大，即不合格，应继续乳化。有时很难乳化至合格，可能系佐剂的质量问题，遇有这种情况，须考虑更换批号或重新配制佐剂。
七．动物免疫
基本免疫方案的确定主要取决于抗原的性质。颗粒性抗原多采用无佐剂免疫法，可溶性抗原较多采用佐剂免疫法。同时还应考虑免疫动物的个体大小，采血方法及采血量等。下面以家兔为例，简要介绍实验动物的免疫操作步骤。
1.无佐剂免疫法
颗粒性抗原一般多采用无佐剂免疫法。将颗粒抗原用PBS或生理盐水配制成混悬液（约1%），按照下列顺序，每次间隔3-5天免疫动物,注射部位和剂量分别为皮下0.3ml，肌肉0.4ml，脚掌0.4ml,静脉0.4ml，皮内0.5ml，贸易次后或于最后1次加强免疫后7天采血，分离血清测定抗体效价。
2.弗氏佐剂免疫法
常规免疫方案为抗原加弗氏完全佐剂皮下多点注射进行基础免疫；再以免疫原加弗氏不完全佐剂作2～5次加强免疫，每次间隔2～3周，皮下、脚掌或腹腔注射加强免疫。具体操作如下：
1）常规免疫
初次免疫：剂量为每只兔子注射1-2 ml弗氏完全佐剂乳化抗原（抗原蛋白含量1～2mg）。注射部位为4只脚掌的皮内各注射200ul，其余分多点注入脊柱二侧，颈部，腹股沟和腋窝等处淋巴结附近部位皮内，每点可注入50-100ul。
再次免疫：初次免疫后20天左右，剂量为1.0ml/只（抗原蛋白含量1 mg），加弗氏不完全佐剂。注射部位在背部和腹部皮下多点注射，每点注入0.1 ml。
加强免疫：再次免疫后2-3周进行，注射剂量和部位同再次免疫，免疫后7～14d抽取少许静脉血，分离血清，试血测定效价。
2）淋巴结免疫
主要优点是可减少抗原用量。基本操作如下：
卡价苗致敏：免疫前足掌皮下每侧各注入活卡价苗（75 mg/ml）0.3 ml。10天左右观察两侧腘窝淋巴结和腹股沟淋巴结，一般可肿胀如蚕豆大小，此时即可进行淋巴结内免疫注射。
初次免疫：用手指固定淋巴结后，在两侧淋巴结内各注入抗原乳剂0.1-0.25ml，每只兔总量0.5-1.0 ml；
再次免疫：于初次免疫20天后，于腹部皮下多点注射不加佐剂抗原溶液1mg/1ml。
加强免疫：二周后可按初次免疫的剂量和途径再注射一次，一般可在加强免疫注射前试血测定效价，效价如已达到要求可不必进行第三次免疫。
有条件的情况下，免疫后要加强动物饲养管理，如添加熟黄豆或胡萝卜等以补充营养。
八.测定抗体效价
一般情况下，在加强免疫后7～10天即可采血，分离出血清之后测定抗体效价。对于免疫原性质不太确定的小分子和多肽片段等半抗原，一般还应在初免后15-20天采血测定抗体效价，以确定抗原的免疫原性和动物的反应性。试血所需的血清量较少，一般可通过兔耳缘静脉、鼠球后静脉或尾尖采血。抗体效价的测定方法有很多，常用的方法有环状沉淀实验，免疫双扩散实验，EIA法等。然而，各实验室更多的是根据实际用途采用实际使用的方法，如蛋白免疫印迹，免疫组化、流式细胞术等直接测定。
1.免疫双扩散法：是免疫血清制备中最常用的试血方法，其具体方法是，在琼脂板中间孔加入10μl抗原（1mg/ml），周围孔依顺时针方向，分别加入用生理盐水或PBS按1:2, 1:4, 1:8，1:16，1:32和1:64的比例稀释的动物免疫血清。经37℃保温24h后观察结果，效价在1:16以上即可决定采血。
2.EIA法：也是免疫血清制备中最常用的试血方法，常用的具体方法有间接ELISA法，竞争ELISA法，捕获法和夹心法等。
3.环状沉淀试验：是较为经典的方法，方便快捷，但目前已较少采用。将一定浓度的抗原200ul加入到环状沉淀管中，然后在抗原液面上加入稀释的免疫血清，如在30 min内，抗原与血清的交界面能出现“艹”的沉淀环，即为阳性反应。如测定抗体效价达1:5000以上时为合格。
九.采血
免疫动物经效价检测合格后即可考虑放血。为减少血清中的脂肪含量，放血前可考虑停食12 h。如拟保留该免疫动物，可直接由心脏取血，或切开耳缘静脉滴血或心脏穿刺取血。取血后可由静脉缓缓注入等量5%葡萄溶液以补足失血量。取血的动物经2～3个月休息，可再次加强免疫后取血。如一次采血即可满足实验需要，可考虑用颈动脉放血的方法，各种取血方法如下。
1.心脏取血：动物于仰卧位固定，用食指探明心脏博动量高部位（在胸骨左侧，由下向上数第3与第4助骨之间），剪去少许毛，用2.5% 碘酒和75%酒精消毒后，以9#针头在预定位置与胸部呈45度角刺入心脏，微微上下移动针头，待见血液进入针筒后，即将注射器位置固定取血。2.5公斤体重的家兔一次可取血20～30ml。
2.耳缘静脉滴血：先将耳缘静脉附近的毛剪去用无菌棉球将皮肤擦干净（不用酒精消毒，避免溶血）。用台灯照射耳部使血管因温度增高而扩张，然后用无菌刀片将耳缘静脉切一长0.5cm的纵切口，第一次切口应从耳尖部开始，以后再切时，逐步向耳根方向移动。用无菌试管或平皿收集流出的血液。如切口凝血，血流不畅时，可用无菌棉棒轻轻将切口外血凝块擦去（注意勿使切口损伤太大），血仍可继续流出，直至达到所需要的血量为止。取血后用无菌棉球压迫切口止血。耳缘静脉取血一次可取血40ml左右而动物不死。
3.颈动脉放血：使动物仰卧固定四肢，颈部剪毛、消毒后纵向切开前颈部皮肤长约10cm，用止血钳将皮肤分开夹住，剥离皮下组织，露出肌层，用刀柄加以分离，即见搏动的颈动脉。小心将颈动脉和迷走神经剥离长约5cm，选择血管中段，远心端用丝线结扎，近心端用血管夹钳住动脉。用无菌剪刀剪一V形缺口。取长2.5cm、直径为1.6mm塑料管一段，将一端剪成针头样斜面，并将此端插入颈动脉中，另一端放入200ml无菌三角瓶内，然后放开止血钳，血即流入三角瓶内，动物流血至死，2.5公斤家兔可放血80～100ml。
十.分离血清
必须在无菌条件下进行，待收集于平皿或三角瓶内的血液凝固之后，用无菌滴管在无菌环境（例如超净工作台）中把血块与瓶壁剥离后，放入37℃，1～2h后取出放入4℃过夜，使血清充分析出（不能冰冻，否则产生溶血）.经离心沉淀分出血清，置超低温冰箱保存。使用前必须经过鉴定，合格后再分装保存备用。
十一.免疫血清的保存
1）经鉴定合格的免疫血清，以1:100比例加入1%的硫柳汞或5%的叠氮钠，使其终浓度分别为0.01%或0.03%。
2）用无菌滴管将抗血清分装小管，每管装1ml左右。
3）-20℃以下保存，可保存2年以上。
4）如有条件可将血清冷冻干燥保存于4℃以下，保存时间更久
十二.注意事项
1、动物的免疫反应存在较大的个体差异，甚至有人报告不同品系动物一次免疫后产生的抗体的差别可高达500倍，所以制备免疫血清时不能只免疫一只动物，一般最好免疫3～4只，因为有的动物抗体效价可能很低或不产生抗体，免疫反应好的动物所能提供的抗体往往高于一般动物3～4倍。
2、为制备单价特异性高的免疫血清，所用抗原纯度越高越好，因此，在纯化抗原过程中应尽量除去可能存在的杂蛋白，这样可以省去许多时间来吸收抗血清中的非特异性抗体。
3、要制备高效价的抗体，必须要加佐剂（一般采用完全福氏佐剂），加佐剂后免疫动物，抗体效价至少可增加5倍。但也应考虑到，如果抗原中有微量的杂蛋白存在，即使只有10ug，亦可能因为有佐剂而产生非特异性的抗体，所以要根据实验需要和抗原的纯度适当地使用佐剂。
4、制成的抗原乳剂是否为油包水乳剂应进行检查，否则会影响免疫效果，如不是油包水乳剂，应重新制备。
5、当抗原量过少不易提纯时，可使用抗原抗体在琼脂扩散中形成的沉淀线直接免疫动物来制备抗体。
6、免疫血清效价一般以免疫血清的稀释倍数表示。血清效价的检测方法很多，灵敏度各不相同，因此在表示抗血清效价时，应标明检测方法。另外，在沉淀反应中，出现沉淀时的抗原、抗体比例有一较大的范围，如用不同浓度的抗原测定效价时，结果会因此有别，所以在测定免疫血清效价时，还应注意所使用的抗原浓度。
7、分装保存的免疫血清应注明抗原的
